2023年10月7日，國家藥品監督管理局發布《關于公開征求《人源干細胞產品非臨床研究技術指導原則（征求意見稿）》意見的通知》，指導原則明確在非臨床研究中需要考慮以下因素（包括但不限于）：細胞來源、生物學特性、作用機制；生產過程（如體外培養、 純化、誘導分化、擴增、基因修飾/改造等）；終產品中不同分化階段細胞的數量/比例；終產品中可能殘留的非目的細胞（如未分化細胞、非預期分化細胞等）、非細胞成分（如雜質/外源因子等）；臨床擬用人群、給藥方式、預期的藥理作用靶部位；細胞在受者體內的遷移、定植、分化及存續能力；細胞的免疫原性和受者對細胞的免疫反應；成瘤性和致瘤性的風險等。對于指導原則中明確的考慮因素，盡早布局相關檢測。
分子檢測
基因表達分析：通過檢測細胞中特定的基因是否被激活或沉默，可以判斷細胞的類型和狀態。例如，人胚干細胞和誘導多能干細胞通常表達一些多能性基因，如OCT4, SOX2, NANOG等，而人的成體干細胞則不表達或表達很低?；虮磉_分析的方法有很多，如實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）、微陣列（microarray）、轉錄組測序（transcriptome sequencing）等。
蛋白質檢測：通過檢測細胞表面或內部的特定的蛋白質，可以判斷細胞的類型和狀態。例如，人胚干細胞和誘導多能干細胞通常表達一些多能性標志物，如SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81等，而人的成體干細胞則不表達或表達很低。蛋白質檢測的方法有很多，如免疫熒光染色（immunofluorescence staining）、流式細胞術（flow cytometry）、免疫印跡法（immunoblotting）等。
表觀遺傳分析：通過檢測細胞中DNA或組蛋白的甲基化、乙?；刃揎?，可以判斷細胞的類型和狀態。例如，人胚干細胞和誘導多能干細胞通常具有一種稱為雙向啟動子（bivalent promoter）的表觀遺傳特征，即同時存在著激活和沉默基因的修飾，使得它們可以在適當的信號下快速分化為不同的細胞類型。而人的成體干細胞則沒有這種特征。表觀遺傳分析的方法有很多，如甲基化敏感性限制酶消化法（methylation-sensitive restriction enzyme digestion）、雙鏈DNA免疫沉淀法（double-stranded DNA immunoprecipitation）、染色質免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation）等。
基本因素檢測
細胞來源：細胞來源是指干細胞產品中的細胞是從哪里獲取的，例如胚胎、臍帶血、骨髓、脂肪等。細胞來源可以通過一些標志物來鑒定，例如表面抗原、轉錄因子、基因表達等。一些常用的檢測方法有流式細胞術、免疫熒光、實時熒光定量PCR等。
生物學特性：生物學特性是指干細胞產品中的細胞具有的一些功能和性能，例如自我更新能力、增殖能力、分化能力、免疫原性等。生物學特性可以通過一些實驗來評估，例如集落形成實驗、細胞周期分析、分化誘導實驗、混合淋巴細胞反應等。
作用機制：作用機制是指干細胞產品在體內發揮治療作用的原理和途徑，例如遷移、定植、分化、分泌因子等。作用機制可以通過一些模型和技術來探究，例如動物模型、熒光標記、基因芯片、蛋白質組學等。
示例：干細胞來源檢測產品
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采用一種基于引物探針的熒光報告系統，利用特異性的引物和探針來擴增和檢測不同來源的干細胞中的特征性基因或轉錄因子。例如，胚胎干細胞中的OCT4、NANOG、SOX2等，臍帶血干細胞中的CD34、CD133等，骨髓間充質干細胞中的CD44、CD90等。
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使用多重實時熒光定量PCR技術，可以在同一反應管中同時檢測多個靶標，并使用不同顏色的熒光染料來區分。這樣可以提高檢測效率和準確性，同時節省試劑和樣品。
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提供一套完整的反應體系和操作流程，包括模板提取、反應混合液配制、PCR反應條件設置、數據分析軟件等。用戶只需按照說明書操作，即可獲得可靠的結果。
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提供一系列的質控品和標準品，用于驗證反應體系的性能和建立標準曲線。通過比較未知樣品的閾值循環數（CT值）和標準曲線，可以計算出未知樣品中干細胞的起始拷貝數和來源。
生產過程檢測
基于微流控芯片的干細胞培養和純化系統，可以實現高效、精確和可控的干細胞培養和分離。利用微流控技術，通過調節培養液的流速、溫度、氣體等參數，模擬干細胞的生理環境，促進其增殖和分化。同時還可以利用微流控閥門和電泳技術，根據干細胞的大小、形狀、電荷等特性，實現干細胞的純化和收集。
基于核酸適配體的干細胞誘導分化，可以實現高效、簡便和特異的干細胞誘導分化。利用核酸適配體技術，通過篩選出能夠特異性結合干細胞表面受體的核酸分子，模擬生長因子或細胞因子的作用，激活干細胞的信號通路，誘導其向目標細胞類型分化。目的要求具有低毒性、低免疫原性、低成本等優點。
基于CRISPR/Cas9技術的干細胞基因編輯工具，可以實現高效、精確和靈活的干細胞基因修飾或改造。該工具利用CRISPR/Cas9技術，通過設計能夠特異性識別目標基因序列的導向RNA（gRNA），結合Cas9核酸酶，實現對干細胞基因組的切割或插入。該工具可以用于增加或減少干細胞的功能基因，或者引入外源基因，改變干細胞的表型或功能。
終產品檢測
基于熒光活細胞成像儀的干細胞分化分析系統，可以實現高通量、高分辨率和動態的干細胞分化過程的監測和定量。該系統利用熒光活細胞成像儀，通過設置不同的波長和濾鏡，對干細胞分化過程中表達的特異性熒光蛋白進行連續拍攝和記錄。通過對圖像進行分析，可以計算出不同分化階段細胞的數量、比例、形態、遷移等參數。該系統可以用于評估干細胞分化效率、穩定性和一致性。
基于流式細胞術的干細胞分化鑒定，可以實現快速、準確和特異的干細胞分化狀態的鑒定。利用流式細胞術，通過使用不同的熒光標記抗體，對干細胞分化過程中表達的特異性表面標志物進行檢測和計數。通過對數據進行分析，可以確定干細胞分化為哪些細胞類型，以及各種細胞類型的數量和比例。最終用于評估干細胞分化質量、純度和多樣性。
基于單細胞轉錄組測序的干細胞分化譜系重建，實現高深度、高靈敏度和高分辨率的干細胞分化過程的解析和重建。利用單細胞轉錄組測序，通過對干細胞分化過程中每個單個細胞的全基因組表達水平進行測定和比較。通過對數據進行聚類、降維、軌跡推斷等方法，揭示干細胞分化過程中的關鍵基因、信號通路、轉錄因子等因素，以及各種分化階段之間的關系和轉換。最終用于評估干細胞分化機制、潛能和多樣性。
非目的殘留檢測
干細胞終產品中可能殘留的非目的細胞和非細胞成分是影響干細胞產品安全性和有效性的重要因素，需要進行嚴格的檢測和控制。
非目的細胞：非目的細胞是指干細胞產品中不符合預期目標的細胞，例如未分化細胞、非預期分化細胞等。這些細胞可能會導致受者體內發生不良反應，如免疫排斥、炎癥、腫瘤等。
細胞表面標志物檢測：利用特異性抗體或熒光染料，對干細胞產品中表達的特定細胞表面標志物進行檢測，以區分不同類型和狀態的細胞。例如，利用CD34、CD133等抗體，檢測干細胞產品中是否含有未分化或部分分化的造血干細胞。一些常用的技術有流式細胞術、免疫熒光、酶聯免疫吸附試驗等。
基因表達檢測：利用特異性引物或探針，對干細胞產品中表達的特定基因或轉錄因子進行檢測，以區分不同類型和狀態的細胞。例如，利用OCT4、NANOG、SOX2等引物或探針，檢測干細胞產品中是否含有未分化或部分分化的多能干細胞。一些常用的技術有實時熒光定量PCR、原位雜交、基因芯片等。
非細胞成分：非細胞成分是指干細胞產品中除了目標細胞以外的其他成分，例如雜質/外源因子等。這些成分可能會影響干細胞產品的質量和穩定性，或者對受者體內造成污染或毒性。
內毒素檢測：內毒素是一種由革蘭氏陰性菌釋放的脂多糖，具有強烈的致炎和致死作用。內毒素可能會污染干細胞產品中使用的培養液、添加劑或器械等。
微生物檢測：微生物是指干細胞產品中可能存在的細菌、真菌、病毒等微小生物，可能會導致干細胞產品的污染或受者體內的感染。
免疫性原性
細胞的免疫原性和受者對細胞的免疫反應是影響干細胞產品安全性和有效性的重要因素，需要進行嚴格的檢測和控制。一些常用的檢測方法有：
細胞的免疫原性：細胞的免疫原性是指干細胞產品中的細胞是否能夠被受者體內的免疫系統識別和攻擊，導致免疫排斥或耐受。細胞的免疫原性主要取決于細胞表面表達的主要組織相容性復合物（MHC）分子，以及其他共刺激分子、附屬分子等。細胞的免疫原性的檢測方法主要有：
MHC分型：利用特異性抗體或探針，對干細胞產品中表達的MHC分子進行檢測，以確定其與受者體內MHC分子的相似度或差異度。一些常用的技術有流式細胞術、PCR-SSP、PCR-SSO等。
共刺激分子和附屬分子檢測：利用特異性抗體或探針，對干細胞產品中表達的共刺激分子和附屬分子進行檢測，以評估其對受者體內T細胞活化或抑制的影響。一些常用的技術有流式細胞術、實時熒光定量PCR等。
受者對細胞的免疫反應：受者對細胞的免疫反應是指干細胞產品在受者體內引發的免疫應答，包括體液免疫和細胞免疫兩種類型。受者對細胞的免疫反應主要取決于干細胞產品與受者體內MHC分子的匹配程度，以及其他因素如給藥方式、劑量、頻率等。受者對細胞的免疫反應的檢測方法主要有：
體液免疫檢測：利用特異性抗體或抗原，對受者血清中存在的針對干細胞產品中細胞或其成分的抗體進行檢測，以評估其對干細胞產品在體內存活和功能的影響。一些常用的技術有酶聯免疫吸附試驗、熒光抗體試驗等。
細胞免疫檢測：利用特異性抗原或抗體，對受者外周血單個核細胞（PBMC）中存在的針對干細胞產品中細胞或其成分的T細胞進行檢測，以評估其對干細胞產品在體內存活和功能的影響。一些常用的技術有混合淋巴細胞反應、ELISPOT、流式細胞術等。
成瘤性和致瘤性
成瘤性和致瘤性的風險是指干細胞產品中的細胞是否能夠在受者體內形成腫瘤或誘發腫瘤，導致嚴重的不良后果。成瘤性和致瘤性的風險主要取決于干細胞產品中的細胞類型、分化狀態、基因穩定性、免疫相容性等因素。
細胞類型和分化狀態檢測：利用特異性抗體或探針，對干細胞產品中表達的特定細胞類型或分化狀態的標志物進行檢測，以評估其是否具有成瘤或致瘤潛能。例如，利用OCT4、NANOG、SOX2等標志物，檢測干細胞產品中是否含有未分化或部分分化的多能干細胞，這些細胞具有較高的成瘤性。利用p53、Rb、Bcl-2等標志物，檢測干細胞產品中是否含有癌變或易癌變的細胞，這些細胞具有較高的致瘤性。一些常用的技術有流式細胞術、免疫熒光、實時熒光定量PCR等。
基因穩定性檢測：利用特異性引物或探針，對干細胞產品中存在的基因突變、缺失、重排等異常進行檢測，以評估其是否影響細胞的正常功能或調控，導致成瘤或致瘤。例如，利用TP53、KRAS、EGFR等引物或探針，檢測干細胞產品中是否含有與腫瘤相關的基因突變。利用FISH、CGH等技術，檢測干細胞產品中是否含有與腫瘤相關的染色體異常。一些常用的技術有實時熒光定量PCR、FISH、CGH等。
免疫相容性檢測：利用特異性抗體或抗原，對干細胞產品中表達的主要組織相容性復合物（MHC）分子進行檢測，以評估其與受者體內MHC分子的匹配程度，以及其對受者體內免疫系統的影響。例如，利用HLA-A、HLA-B、HLA-C等抗體，檢測干細胞產品中是否含有與受者相同或相似的MHC I分子，這些分子可以減少免疫排斥反應，但也可能增加腫瘤逃逸反應。利用HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等抗體，檢測干細胞產品中是否含有與受者不同或不相似的MHC II分子，這些分子可以增加免疫監視反應，但也可能增加免疫攻擊反應。一些常用的技術有流式細胞術、PCR-SSP、PCR-SSO等。
2023-10-16 |
